最终诊断 765.隐蔽、狡猾、善变

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    放疗(rt)是肺癌必不可少的治疗方式。茶壶小说网 www.chahu123.com对于不适合手术的iiia&nbp;和&nbp;iiib&nbp;期肺癌患者，根治性放化疗是治疗标准，这一点已被广泛接受。不幸的是，放疗后肿瘤的再生长是成功控制疾病的主要障碍。

    临床前研究表明，放疗对原发部位和转移部位的肿瘤免疫微环境具有双重作用。一方面，局部照射有可能激活针对远离照射区域的肿瘤细胞的全身免疫反应，即远隔效应，由e&nbp;在&nbp;1953&nbp;年首次报道。rt促进肿瘤抗原从垂死的肿瘤细胞中释放，上调h&nbp;i&nbp;类表达，并增加多种细胞因子和免疫效应分子的表达，包括白细胞介素(i)-1、细胞间粘附分子&nbp;1&nbp;(ia1)和血管细胞粘附分子1&nbp;(va1)，所有这些都有助于由辐射引发的持久和全身抗肿瘤免疫。另一方面，放疗促进了肿瘤细胞的免疫逃避。例如，rt上调多种免疫抑制细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、i-6、i-10&nbp;和转化生长因子-β(tgf-β)。rt&nbp;促进免疫抑制细胞的积累，例如肿瘤相关巨噬细胞(ta)、调节性t&nbp;(treg)细胞和髓源性抑制细胞(d)。辐射增强免疫检查点的活性，如程序性细胞死亡蛋白1&nbp;(pd-1)/pd-1、细胞毒性&nbp;t&nbp;淋巴细胞相关蛋白4&nbp;()、t&nbp;细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域的蛋白3&nbp;(ti3)，和淋巴细胞激活基因3&nbp;(g3)。

    为了克服放疗的免疫抑制作用，已经提出并测试了免疫疗法和放疗的各种组合。在&nbp;paifi&nbp;研究中，标准放化疗后加入durvauab可延长iii&nbp;期&nbp;n&nbp;患者的无进展生存期和总生存期。paifi&nbp;研究的巨大成功不仅改变了iii&nbp;期非小细胞肺癌的临床指南，也引起了其他免疫疗法与rt&nbp;结合的极大兴趣。

    d的积累和激活在免疫抑制的建立中起关键作用。rt&nbp;对&nbp;d&nbp;的确切影响是复杂的。大分割照射(20&nbp;gy)抑制&nbp;d&nbp;的积累和浸润，而较低剂量的照射往往会促进&nbp;d&nbp;募集到肿瘤中。此外，临床前和临床研究表明，胃肠道肿瘤，包括结直肠癌和肝癌，在放疗后相对容易出现d&nbp;水平降低，而在其他肿瘤模型和临床环境中，如胶质瘤、肺癌、乳腺癌、头颈部鳞癌、前列腺癌和宫颈癌，导致d&nbp;数量持续增加。蔡等人首次报道&nbp;d的&nbp;pd-1&nbp;表达被辐照上调。然而，关于d&nbp;的确切作用，尤其是其潜在机制，在辐照后塑造te&nbp;方面知之甚少。

    d是一组具有强大免疫抑制能力的异质髓细胞。根据表型和形态，d又可分为多形核d(pn-d，又称粒细胞型d)和单核型d(-d)。

    免疫抑制活性是d的关键标志。d的抑制机制包括诱导型一氧化氮合酶()、精氨酸酶1(arg1)和吲哚胺2，3-双加氧酶(id)的表达，以及一氧化氮(n)和活性氧(r)的产生。这些不同的机制不会同时起作用。人们普遍认为pn-d和-d通过不同的机制调控te。此外，pd-1的上调也被认为是辐射招募d的免疫抑制机制之一。目前，对于辐照诱导的d对te的影响及放疗的治疗效果尚无一致的结论。

    磷酸二酯酶-5(pde5)抑制剂，如西地那非和他达拉非，可以阻断环磷酸鸟苷(gp)的水解。最新数据表明，pde5&nbp;抑制剂能够通过抑制荷瘤(tb)小鼠和患者d&nbp;中&nbp;和&nbp;arg1的活性和表达来促进抗肿瘤免疫。然而，pde5&nbp;抑制剂如何影响d&nbp;的亚群以及rt&nbp;和&nbp;pde5&nbp;抑制剂的组合是否会延迟辐射后的肿瘤再生尚未得到测试。

    我们最近的研究表明，消除招募的d&nbp;会延迟放疗后路易斯肺癌()的再生。在这里，我们报告了局部照射通过促进pn-d&nbp;的增殖及其随后向te&nbp;的募集而削弱了抗肿瘤免疫力。arg1的上调和激活是照射后pn-d介导的t细胞抑制的主要机制。西地那非与放疗的组合通过抑制&nbp;arg1&nbp;过表达和&nbp;pn-d&nbp;募集消除了辐射衍生的免疫抑制。

    在tb&nbp;小鼠和癌症患者中，d随着肿瘤的生长而扩增。d&nbp;的两个亚群之间的比例取决于特定的肿瘤模型和微环境。为了监测同源&nbp;模型中d&nbp;的丰度，我们通过免疫表型分析确定了接种后肿瘤的生长以及&nbp;小鼠中不同时间点的总体d&nbp;及其亚群。

    如图1所示，肿瘤组织中总d的百分比随着肿瘤的发展而稳步增加，从接种后第一周肿瘤浸润淋巴细胞的不到10（584±122）上升到第四周超过20（2171±&nbp;322）（p<001）。在我们的&nbp;模型中，pn-d占总d&nbp;的&nbp;9494&nbp;±847，并且与总d&nbp;具有相同的肿瘤发展趋势（p&nbp;<&nbp;005）。对亚群进行分析，虽然-d&nbp;增加了大约5&nbp;倍，但差异没有统计学意义。

    为了更好地了解d&nbp;的全身分布，我们还研究了d&nbp;在外周血、脾脏和骨髓中的比例。仅在接种细胞一周后，tb小鼠外周血中的d百分比是无瘤小鼠的两倍(2733±462v&nbp;1248±093，&nbp;p<005)，&nbp;3周后的d百分比是无瘤小鼠的5倍(2733±462&nbp;v&nbp;1248±093，p<005)。tb小鼠外周血中pn-d的比例也增加，而-d的比例与肿瘤大小无关。

    pd-1&nbp;是肿瘤细胞、d、巨噬细胞和树突状细胞表达的最重要的检查点分子之一。为了确定tb&nbp;小鼠d&nbp;的&nbp;pd-1&nbp;表达是否与健康小鼠不同，我们通过流式细胞术测试了d&nbp;的&nbp;pd-1&nbp;表达。结果表明，te中d上pd-1的平均荧光强度（fi）从在&nbp;&nbp;细胞接种后的第一周3868±&nbp;1009&nbp;逐渐增加到第四周的1，0680&nbp;±1218&nbp;（&nbp;p&nbp;<001），这表明pd-1&nbp;在我们模型中的d&nbp;中具有潜在作用。

    在脾脏和骨髓中，随着肿瘤的发展，d的比例也显著增加，其模式与肿瘤组织和外周血中的d相同。此外，我们在tb小鼠中观察到明显的脾肿大，这与我们观察到的d在脾内聚集一致。

    为了确定局部照射对肿瘤生长和d的影响，当肿瘤直径达到75&nbp;时，我们使用大分割rt(20&nbp;gy/f)治疗皮下肿瘤。放疗导致肿瘤进展延迟长达一周，在第7至第10天的最小体积约为500&nbp;3，但此后肿瘤开始再生。根据放疗前后肿瘤生长曲线，我们选择放疗后第3天为再生前生长，放疗后1周为肿瘤体积最小时为再生开始，放疗后2周和3周为再生阶段。肿瘤组织苏木精-伊红染色显示，与未治疗的肿瘤相比，放疗后的肿瘤中有更多的浸润性炎症细胞。随后的d11b特异性免疫组化染色显示，大多数炎症细胞是d11b+髓系细胞，这表明局部照射可能导致d的积累。为了证实我们的假设，我们在局部照射后的不同时间点对总d和这两个亚群进行了流式细胞术分析。局部照射后，放疗后肿瘤浸润d的比例比未治疗肿瘤高2倍(trv&nbp;rt=2133±329&nbp;v&nbp;4410±300，p<0001)。pn-d与总d具有相同的增加趋势(trv&nbp;rt=1637±247&nbp;v&nbp;3866±424，p<0001)，而-d比例保持在约01，且与肿瘤大小和治疗无关。外周血情况同肿瘤组织。

    为了确定受照射肿瘤中pn-d&nbp;的逐渐积累是否有助于&nbp;肿瘤的再生长，或者这种积累是否仅仅是肿瘤生长的结果，使用抗y-6g&nbp;单克隆抗体来消耗d&nbp;抗y-6g抗体的应用显着降低了肿瘤部位和外周血中pn-d的频率（p<005）。此外，用抗&nbp;y-6g&nbp;抗体治疗大大延迟了照射后的再生，这表明pn-d的募集对肿瘤再生至关重要。

    虽然pn-d利用一系列机制来抑制抗肿瘤免疫反应，这涉及到许多免疫细胞和细胞因子，但对d8+t细胞的抑制无疑是最重要的。为了确定rt&nbp;后&nbp;pn-d&nbp;诱导的免疫抑制是否依赖于d8&nbp;+&nbp;t&nbp;细胞，我们通过流式细胞术评估了d8&nbp;+&nbp;t&nbp;细胞的数量和功能。

    如图3d&nbp;所示，d8&nbp;+&nbp;t&nbp;细胞的百分比随着照射从1171±&nbp;231下降到242&nbp;±062(p<001)。pn-d耗竭逆转了这种下降（&nbp;rt&nbp;+&nbp;anti-y-6g&nbp;抗体=&nbp;242&nbp;±062&nbp;v&nbp;2012&nbp;±392，p<001）。为了更好地了解d8&nbp;+&nbp;t&nbp;细胞浸润肿瘤部位的功能状态，我们测量了d8+&nbp;t&nbp;细胞内部和表面上ifn-γ、d28&nbp;和&nbp;pd-1&nbp;的表达。局部&nbp;rt&nbp;显着降低了&nbp;d8&nbp;+t&nbp;细胞分泌&nbp;ifn-γ的比例，从3306&nbp;453降至1325&nbp;208，并增加了表达&nbp;pd-1&nbp;的&nbp;d8&nbp;+&nbp;t&nbp;细胞的比例（trv&nbp;rt=25320±&nbp;5703&nbp;au&nbp;v&nbp;53880&nbp;±9876）&nbp;au，p<005）。

    d28&nbp;表达未观察到显着变化。当抗y-6g抗体被给予辐照小鼠时，ifn-γ分泌达到与未处理的&nbp;&nbp;小鼠相同的水平（2974±355），而与辐照小鼠进行比较抗y-6g抗体处理后的pd-1&nbp;表达没有变化小鼠。因此，在这部分我们建议pn-d&nbp;通过抑制d8&nbp;+&nbp;t&nbp;细胞促进放疗后肿瘤的再生。pn-d&nbp;不仅抑制了te&nbp;中&nbp;d8&nbp;+&nbp;t&nbp;细胞的数量，而且还抑制了其活性。

    为了确定辐照诱导d的抑制机制，我们进行了免疫组化染色及和arg1活性检测。肿瘤切片的免疫组化染色显示，局部rt增强了arg1的表达，但没有增强的表达。arg1活性测定表明，局部照射显著提高了arg1的活性，从040015&nbp;u/提高到378&nbp;039&nbp;u/&nbp;((p<001)。相比之下，n荧光标记的活性检测显示，辐照和未处理的肿瘤组织样本的荧光强度相似。

    pd-1的表达是d&nbp;的一种新型免疫抑制机制。然后我们询问pd-1&nbp;上调是否是rt&nbp;后&nbp;d&nbp;介导的免疫抑制的机制之一。通过流式细胞术分析辐照后d&nbp;中&nbp;pd-1&nbp;的表达。图4e&nbp;显示，与未处理组相比，受照射肿瘤的d&nbp;中的pd-1&nbp;表达在照射后不久显着增加（照射后第三天trv&nbp;rt=4439&nbp;±1753&nbp;au&nbp;v&nbp;13280&nbp;±3243&nbp;au，p<005）然而，此后pd-1表达继续下降，局部照射组在照射后第3周显着低于未治疗组（tr&nbp;v&nbp;rt=1，4650±&nbp;3996&nbp;au&nbp;v&nbp;4075±1648&nbp;au，p<005）。外周血中d&nbp;的&nbp;pd-1&nbp;表达与局部肿瘤部位的表达趋势相同。

    以上数据表明arg1表达的上调是照射后pn-d抑制功能的合理机制。然而，不涉及&nbp;pd-1&nbp;和&nbp;的调节。为了进一步证实这一假设，在辐射后通过灌胃给予arg1&nbp;抑制剂nr-nha。10&nbp;g/g/d&nbp;nr-nha&nbp;有效地将arg1&nbp;活性从378&nbp;039&nbp;u/&nbp;降低到202&nbp;025&nbp;u/（p<001）。

    rt后给予nr-nha显着增加d8+t细胞比例（rt&nbp;v&nbp;rt+nr-nha=242062&nbp;v&nbp;614&nbp;064，&nbp;p<001），并伴有肿瘤再生延迟。抑制剂1400&nbp;对肿瘤再生长没有影响。

    我们的结果表明，rt通过上调肿瘤内pn-d&nbp;的百分比和arg1&nbp;活性来促进肿瘤免疫逃避。推测抑制pn-d&nbp;及其arg1&nbp;活性可能是一种新的抗肿瘤策略是合理的。越来越多的证据表明，pde5&nbp;抑制剂可以抑制tb&nbp;小鼠和癌症患者d&nbp;中&nbp;和&nbp;arg1&nbp;的活性和表达。因此，通过灌胃给予西地那非20&nbp;g/g/d，以研究它是否可以促进rt&nbp;的抗肿瘤作用并阐明潜在机制。如图5b&nbp;所示，正如我们预期的那样，西地那非延迟了照射后的肿瘤再生长，这与阳性对照nr-nha&nbp;相当。te&nbp;的免疫特征表明，当给予西地那非时，肿瘤内pn-d&nbp;的比例从3866±424下降到2357±238。

    此外，西地那非也显着降低了arg1&nbp;的表达。为了进一步检查西地那非对d&nbp;的抑制是否真的导致抗肿瘤免疫增强，我们分析了肿瘤内d8&nbp;+&nbp;t&nbp;细胞的比例和活性。流式细胞术分析表明d8&nbp;+&nbp;t&nbp;细胞的百分比从242&nbp;±&nbp;062增加到721&nbp;±&nbp;122。

    此外，当给予西地那非时，d8&nbp;+&nbp;t&nbp;细胞分泌的ifn-γ也显着升高。因此，我们证实pde5&nbp;抑制剂西地那非通过调节pn-d&nbp;改善了照射后肿瘤免疫微环境。西地那非联合放疗可能是提高放疗疗效的一种有前景的策略。

    工作揭示了pn-d中arg1通路介导rt后肿瘤再生的新机制，如图6所示。我们认为，pn-d是辐照招募的主要亚型，而不是-d。在广泛的免疫抑制机制中，arg1的上调和激活是pn-d在放疗后抑制d8+t细胞的主要机制。为了克服pn-d引起的免疫抑制，我们提出并证明，idenafi和rt联合使用降低了pn-d在te内的募集和免疫抑制作用，激活了d8+&nbp;t细胞应答，导致肿瘤生长延迟。综上所述，我们的研究结果为缓解免疫抑制te以提高rt治疗效果提供了一种新的解决方案。虽然所有这些结果都是在小鼠模型中进行的，但同样的机制是否适用于其他肿瘤模型尚不清楚。此外，在不同的辐射方案下，d及其亚型如何影响te仍未确定。因此，这些问题还需要进一步的研究来解决。

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